近年來,蛋白發(fā)光染液的標記技術(shù)在材料科學(xué)、生物技術(shù)和檢測方法等領(lǐng)域取得了顯著進展,以下是當(dāng)前正在研發(fā)的新型技術(shù)及其應(yīng)用突破:
深圳灣實驗室蔡羽軒課題組通過優(yōu)化TAMM 縮合反應(yīng),將其反應(yīng)速度提升 1000 倍以上,并結(jié)合基因密碼子擴展技術(shù)與序列特異性蛋白酶,成功實現(xiàn)了三種不同膜蛋白的特異性標記1。該技術(shù)通過巧妙組合生物正交反應(yīng),可進一步實現(xiàn)四色熒光標記,達到共聚焦顯微鏡的成像顏色上限。更重要的是,這種方法還能在小鼠活體中實現(xiàn)雙色熒光標記,為多靶點動態(tài)研究提供了可能。這種技術(shù)突破解決了傳統(tǒng)熒光蛋白體積大、光穩(wěn)定性不足的問題,同時通過小分子染料的高亮度特性提升了成像精度。
南開大學(xué)龐代文團隊開發(fā)的量子點單病毒追蹤技術(shù)(QSVT),利用量子點的高亮度、窄發(fā)射譜和的光穩(wěn)定性,實現(xiàn)了活細胞中病毒感染過程的長期實時監(jiān)測2。該技術(shù)通過標記病毒的內(nèi)外組分,結(jié)合熒光顯微鏡和圖像處理算法,可解析病毒從進入宿主細胞到釋放基因組的完整動態(tài)路徑。例如,在 HIV 病毒研究中,QSVT 技術(shù)揭示了病毒與宿主細胞膜融合的納米級動力學(xué)細節(jié),為抗病物開發(fā)提供了直接證據(jù)。
河南大學(xué)楊文勝課題組通過調(diào)控 NaOH 的加入時間和濃度,在低牛血清白蛋白(BSA)濃度下合成了熒光金納米簇,并揭示了其發(fā)光性質(zhì)的調(diào)控機制3。這種納米簇不僅在金屬離子傳感中表現(xiàn)出高靈敏度,還因其生物相容性被用于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的標記。例如,通過表面修飾靶向肽段,金納米簇可特異性標記腫瘤細胞表面的 HER2 受體,結(jié)合近紅外成像實現(xiàn)活體腫瘤的高對比度可視化。
賽默飛世爾的TrueTag 供體 DNA 試劑盒結(jié)合 CRISPR-Cas9 技術(shù),實現(xiàn)了無需克隆步驟的快速基因標記4。該技術(shù)通過一步 PCR 法制備供體 DNA,可在目的蛋白的 N 端或 C 端插入 GFP、RFP 等熒光標記或表位標簽(如 HA、FLAG),編輯效率高達 100%。北京大學(xué)陳匡時課題組開發(fā)的CRISPR/MB 系統(tǒng),則將分子信標(MB)與 dCas9-sgRNA 復(fù)合體結(jié)合,實現(xiàn)了活細胞中單基因位點的超分辨成像5。例如,在端粒和著絲粒的雙色標記中,該技術(shù)的定位精度達到 50 納米以內(nèi),顯著優(yōu)于傳統(tǒng)熒光蛋白標記。
中國科學(xué)院徐濤團隊開發(fā)的mEosEM 蛋白,實現(xiàn)了抗鋨酸固定和環(huán)氧樹脂包埋的熒光標記7。這種蛋白在電鏡超薄切片后仍能保持熒光亮度和光開關(guān)活性,結(jié)合單分子定位超分辨成像技術(shù),可在保留線粒體等亞細胞超微結(jié)構(gòu)的同時,實現(xiàn)納米級精度的蛋白質(zhì)定位。例如,在神經(jīng)元突觸囊泡的研究中,mEosEM 標記的突觸素蛋白與電鏡圖像的關(guān)聯(lián)分析,揭示了突觸囊泡在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中的動態(tài)重組機制。
Alexa Fluor 680 等近紅外熒光染料通過標記卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA),在活體動物成像中展現(xiàn)出優(yōu)勢89。其近紅外發(fā)射波長(694 nm)有效減少了組織自發(fā)熒光干擾,適用于深層組織(如小鼠腦區(qū))的蛋白質(zhì)分布分析。例如,在腫瘤轉(zhuǎn)移模型中,Alexa Fluor 680 標記的抗體可穿透 1 厘米厚的組織,清晰顯示腫瘤細胞表面 PD-L1 蛋白的表達水平,為免疫治療監(jiān)測提供了新工具。
復(fù)旦大學(xué)袁鵬團隊開發(fā)的雙光子激發(fā)熒光轉(zhuǎn)移(TEFT)技術(shù),通過將熒光蛋白或有機染料與光遺傳學(xué)通道蛋白共定位,實現(xiàn)了單細胞精度的光控激活6。例如,在血管壁細胞研究中,雙光子照射血管內(nèi)的 Alexa 594 染料,其激發(fā)光通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移激活鄰近的 ReaChR 通道蛋白,引發(fā)局部血管收縮。該技術(shù)的空間分辨率達到 1 微米以下,且所需激光能量僅為傳統(tǒng)雙光子刺激的 1/3,顯著降低了光毒性。
基于蛋白質(zhì) - DNA 相互作用的BRET 體系通過優(yōu)化標記方法和實驗條件,提升了檢測靈敏度和穩(wěn)定性10。例如,將熒光供體(如 GFP)與 DNA 結(jié)合蛋白融合,受體(如 RFP)標記 DNA 序列,當(dāng)兩者結(jié)合時,BRET 信號增強,可實時監(jiān)測轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的動態(tài)結(jié)合過程。在藥物篩選中,該體系可快速評估小分子化合物對蛋白質(zhì) - DNA 相互作用的干擾效果,加速靶向藥物開發(fā)。
這些新型標記技術(shù)的研發(fā),不僅提升了蛋白檢測的靈敏度和多重性,還拓展了其在動態(tài)過程研究、活體成像和精準醫(yī)療中的應(yīng)用。未來,隨著材料科學(xué)與生物技術(shù)的進一步融合,如 AI 驅(qū)動的標記策略優(yōu)化和自組裝納米載體的應(yīng)用,蛋白發(fā)光染液的標記技術(shù)將朝著更高特異性、更低毒性和更智能化的方向發(fā)展。